Молекулярно-генетические методы исследования и дифференциальная диагностика туберкулеза

Роль метода полимеразно-цепной реакции в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания. Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

Размещено на

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Учреждение образования

«Гомельский государственный медицинский университет»

Медико-диагностический факультет

Кафедра фтизиопульмонологии

Молекулярно-генетические методы исследования и дифференциальная диагностика туберкулеза

Дипломная работа

Исполнитель:

студент группы Д-603 Гореньков Р.Ю.

Руководители:

К.м.н., Заведующий кафедры

фтизиопульмонологии Буйневич И.В.

Зав. клинико-диагностической

лаборатории УЗ “Гомельская

областная туберкулезная

клиническая больница” Золотухина Л.В.

ГОМЕЛЬ, 2013 г



Реферат

Дипломная работа содержит 31 страницу, 5 рисунков, 4 таблицы, 15 источников.

Ключевые слова: Микобактерии туберкулеза, ПЦР диагностика, Дифференциальная диагностика туберкулеза, лекарственная чувствительность, DNA-Strip метод.

Объект исследования:

46 проб для ПЦР исследования культур взятых с плотных и жидких (BACTEС MGIT 960 )питательных сред.

30 проб для определения лекарственной чувствительности одних и тех же пациентов по данным ПЦР и BACTEC MGIT 960

Цель работы: изучить информативность DNA-Strip метода в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза.

Область применения: микробиологическая лабораторная диагностика, фтизиатрия, организация здравоохранения.



Содержание:

Перечень сокращений

Введение

Глава 1. Основы проведения метода ПЦР

1.1 основной принцип ПЦР

1.2 Осуществление рутинных методик ПЦР

1.3 Разновидность ПЦР

1.4 ПЦР диагностика туберкулеза легких

1.5 ПЦР диагностика внелегочных форм туберкулеза

1.6 Роль метода ПЦР в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Предварительная обработка мокроты

2.2.2 Подготовка пробирок и посев образца для автоматизированной системы BACTEC MGIT 960

2.2.3 Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видомикобактерий из культурального материала

2.2.4 Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1 Обнаружение и видовая идентификация МБТ

3.2 Продолжительность молекулярно-генетического метода исследования

3.3 Определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам

Заключение

Список литературы

Перечень сокращений

молекулярный генетический туберкулез диагностика

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

МБТ - микобактерии туберкулеза

dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфатов

PBS-буфер - натрий-фосфатный буфер

ПТП - противотуберкулезные препараты

ППС - плотные питательные среды

ЛУ - лекарственная устойчивость



Введение

ДНК-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека.

ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР (полимеразной цепной реакции, Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) .

На сегодняшний день ПЦР - анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики. Ежегодно на рынке появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей различных заболеваний, так и мутаций генов человека, животных и растений. Количество ПЦР-лабораторий неуклонно увеличивается, а ПЦР-анализ становится все более востребованным среди специалистов и пациентов.

Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии [2].

Особое место метод ПЦР нашел в диагностике туберкулеза. Традиционные микробиологические методы выявления возбудителя не всегда позволяют подтвердить диагноз туберкулез. Метод люминесцентной бактериоскопии и посева на питательные среды обладают низкой чувствительностью и обнаруживают М.tuberculosis в среднем лишь у 50-60% больных активным туберкулезом легких. В связи с этим внедрение в практику новых молекулярно-генетических методов исследования способствует проведению диагностики туберкулеза в максимально короткие сроки и с наибольшей чувствительностью.

Цель работы: изучить информативность DNA-Strip метода в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза.

Задачи:

Изучить возможность метода ПЦР в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза.

Оценить возможности DNA-Strip метода в в диагностике и дифференциальной диагностикетуберкулеза.

Сравнить возможности ПЦР и Bactec MGIT960 при видовой идентификации туберкулеза и их лекарственной чувствительности к ПТП.



Глава 1. Основы проведения метода ПЦР.

1.1 Основной принцип ПЦР

Любой метод ДНК-диагностики основан на специфической гибридизации двух нитей ДНК, комплементарных (структурно дополняющих) одна другой. Примерной (хотя и весьма приблизительной) аналогией может служить серологическая реакция, основанная на специфической реакции белка-антитела с соответствующим антигеном. Специфичность связывания нитей в спирали ДНК основана на связях А-Т и Г-Ц. Праймеры комплементарны искомым участкам ДНК, и поэтому они способны связываться с конкретными участками гена. Достройка нитей ДНК, начиная с добавленных праймеров, требует наличия в реакционной смеси пурин-и пиримидинтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ и ЦТФ), а также присутствия ДНК-полимеразы, которая соединяет их в цепочку согласно последовательности второй нити ДНК [3].

1.2 Осуществление рутинных методик ПЦР

Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, сок простаты, слюна, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты.

Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.

Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150 °С в течение 1 часа[4].

1. Выделение ДНК из клинического образца производится любым способом. Основное требование - достаточно стандартный выход продукта и интактность, сохранение двухнитевой структуры.

Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. В случаях, когда не требуется достижения высокой чувствительности анализа, например, при идентификации МБТ после первичного культивирования, достаточна их обработка, позволяющая лишь разрушить микробную стенку: нагревание в лизирующем буфере, ультразвуковая обработка или использование ферментов (лизоцим) без последующего выделения ДНК.

При отсутствии в пробе ингибиторов Taq-полимеразы (гемоглобина или других) и наличия десятка копий ДНК-матрицы в объеме, вносимом в пробирку со смесью всех реагентов ПЦР, подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В большинстве случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом [1]. Благодаря этому происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-полимеразы.

В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в при...