Полиакриламидный гель (ПААГ)
Реферат на тему:Полиакриламидный гель (ПААГ)20091. Полиакриламидный гель (ПААГ)Это — продукт полимеризации акриламида. В результате разрывов двойных связей и конденсации по ним получаются длинные бесцветные нити линейного полимера полиакриламида. Эти нити могут быть ковалентно связаны («сшиты») между собой. Конечно, в реальных полимерах нити полиакриламида вовсе не параллельны, а расположены хаотически, но в отдельных точках своего сближения они сшиты мостиками «Биса». Получаются неправильной формы поры пространственной решетки, средний размер которых, тем не менее, определяется частотой расположения сшивок и концентрацией основных нитей полимеров.Оба мономера: акриламид и «Бис» представляют собой хорошо растворимые в водной среде порошки. Образование пространственной сетки геля происходит прямо в растворе выбранного буфера, который благодаря этому заполняет все поры геля.Полимеризацию стимулируют добавки в малых количествах еще двух веществ. Одно из них служит инициатором процесса полимеризации, второе — ускоряет этот процесс.Содержание водной фазы в геле очень велико — от 70 до 97%.Пористость и механические характеристики ПААГ задают путем выбора процентного отношения суммарной массы обоих полимеров к объему геля. Эту величину принято обозначать буквой Т. Практически она варьирует от 3 до 30%. Вес сшивки («Биса») составляет обычно от 1 до 5% суммарного веса мономе-ров. Эту величину обозначают буквой С. При малых значениях сшивки (С<2%) ПААГ нельзя считать жесткой регулярной пространственной решеткой. Скорее это — длинные нити, лишь в отдельных точках, случайным образом связанные между собой. Расстояние между этими точками вдоль нити в среднем составляет 50—100 мономерных единиц. Мигрирующие в геле молекулы белка могут раздвигать длинные, гибкие участки линейных полимеров акриламида. На это расходуется энергия, что также сказывается замедлением миграции.ПААГ хорошо прилипает к чисто вымытому стеклу.В свободной жидкости скорость миграции большинства кислых белков при рН8,5 составляет 0,1-0,5 см/час при напряженности поля 1 В/см. Для эффективного разделения белков в ПААГ, как показывает опыт, средняя скорость их миграции (благодаря сопротивлению геля) должна быть в 5-10 раз меньше. При нормальной напряженности электрического поля в 10-20 В/см этому соответствует средняя скорость миграции белков в геле порядка 0,1-2 см/час. Таким образом, при рабочей длине геля в 20 см за 10 часов электрофореза наиболее быстрые белки могут достигнуть нижнего конца геля в то время, как наиболее медленные продвинутся лишь на 1 см. Напряжение, которое при этом должно подаваться на трубочку геля, составит 200—400 В. Цифры эти, конечно, сугубо ориентированные.Выбор значения Т зависит от характера электрофоретических подвижностей белков в геле. Если сильно различаются размеры белковых молекул, а отношение заряда к массе у них более или менее одинаковое, то имеет смысл выбрать Т максимальным. Разделение в этом случае будет происходить в основном за счет трения о гель. Причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза усилится диффузия белков в полосах. Если же компоненты анализируемой смеси имеют заведомо различные отношения заряда к массе, то может оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле (при малых значениях Т), то есть как бы в свободной жидкости.В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать следующую, полученную на практике, таблицу соответствия молекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций ПААГ (Т):М (тыс. дальтон) Т (%) 10-40 15-20 40-100 10-15 100-300 5-10 >300 52. Электрофорез белков в вертикальных пластинахПервые опыты с электрофорезом белков ставились в вертикально стоящих трубочках. Для простоты изложения я в этой системе рассматривал и основные особенности электрофореза, не зависящие от формы геля. Однако в ходе эксплуатации довольно скоро выяснилось, что система трубочек неудобна в двух отношениях. Во-первых, в трубочке трудно добиться одинакового охлаждения геля по всему ее сечению. Во-вторых, для сравнения результатов электрофореза нескольких сопоставляемых препаратов белков нужно было приготовить столько же отдельных трубочек в совершенно одинаковых условиях состава и полимеризации ПААГ, что затруднительно. Поэтому с середины 70-х годов электрофорез белков ведут исключительно в вертикально расположенных пластинах (рис. 1).2-ПРОКЛАДКИ; 3-ПЛЕНКА; 4-ЗАЖИМРис. 1Обычно используют пластины шириной 8-14 см и длиной до 30 см. Полимеризацию акриламида, а затем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зеркального стекла толщиной 5 мм. Переднее стекло (на рис. 37) имеет вырез, назначение которого будет ясно из дальнейшего.Расстояние между пластинами, — а значит и толщина геля, — задается толщиной прокладок из тефлона (0,4-1,5 мм) при ширине 10-15 мм (на рисунке они показаны пунктиром). Эти прокладки устанавливают по бокам и внизу формы, при условии плотного прилегания нижней прокладки к торцам боковых. Нижняя прокладка — немного выступает за пределы формы, поскольку после затвердевания геля ее надлежит удалить. Тефлон хорошо прилегает к зеркальному стеклу, а нижние торцы боковых прокладок можно слегка смазать силиконовым маслом. Прокладки между стеклами надежно зажимают по всей периферии пружинными зажимами для бумаг. (На рисунке показаны только 4 зажима с одной стороны пластины.) Вся камера таким образом должна быть надежно герметизирована, кроме верхнего ее края, на то время, пока в ней будет проходить полимеризация жидкой смеси предшественников ПААГ.По окончании этого процесса (о чем можно судить по образованию резкой границы между гелем и тонким слоем воды, которым защищают полимеризацию от контакта с кислородом воздуха) зажимы можно снять. Полимеризация занимает обычно 30-40 минут.В аналитических опытах на каждой пластине в параллельных «треках» ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых затем можно сопоставлять при строго одинаковых условиях разделения (рис.2 ).Рис2. Для фиксации этих треков в ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы «карманов», куда затем и вносят различные препараты.Для этого в еще не заполимеризовавшийся гель вставляют «гребенку» из тефлона, такой же толщины, как прокладки между стеклами. Как видно на разрезе, верхняя часть гребенки делается немного толще, чем нижня...
Другие файлы:
Полиакриламидные гидрогели в медицине
Области применения в медицине синтетических полимеров. Материалы, применяемые для имплантации. Физиологически активные водорастворимые полимеры. Струк...
Основы золь-гель-технологии нанокомпозитов
Рассмотрены особенности золь-гель-технологии нанокомпозитов, свойства получаемых материалов и методы их исследования, а также со-временное состояние з...
Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Строение и физико-химические свойства лактоферрина. Методы рентгеновской и оптической дифракции. Ознакомление с условиями проведения гель-хроматографи...
Получение модифицированного пленкой стекла
Организация контроля и управление качеством покрытий, получаемых по золь-гель технологии. Схема изготовления модифицированного золь-гель пленкой издел...
Плазменные покрытия из порошка диоксида циркония, полученного по золь-гель-технологии
Сущность и преимущества золь-гель-технологии синтеза порошков диоксида циркония, стабилизированного оксидом иттрия. Технологические свойства, структур...
