Метод PCR Real Time в диагностике мутаций EGFR

Оценка возможности использования генетических маркеров опухолевой ткани при раке легких. Определение частоты возникновения мутаций в гене EGFR. Влияние вдыхаемого табачного дыма на возникновения мутаций. Зависимость выбора тактики лечения от мутаций.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

Размещено на

Министерство образования и науки российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Кубанский государственный университет»

Кафедра биохимии и физиологии

Выпускная квалификационная работа Бакалавра

метод PCR real time в диагностике мутаций EGFR

Работу выполнил Л.А. Кондратова

Научный руководитель М.Л. Золотавина

Краснодар 2013

Реферат

Исследование выполнено на базе генетической лаборатории Краснодарского онкологического диспансера №1, период с 26.06.2012 по 26.05.2013г.

Цель работы: оценка возможностей использования генетических маркеров опухолевой ткани при раке легких.

Объект исследования - опухолевая ткань больных раком легких, представленная гистологическими блоками эпителиальной ткани легких.

Методом в данной работе служила полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Этот метод служит для выявления мутаций в ДНК материале.

В результате данного исследования было выявлено наличие мутаций у 29,4% больных раком легких, а так же были выявлены некоторые закономерности в возникновении мутаций в гене EGFR.

Содержание

Введение

1. Аналитический обзор

1.1 Мутации и их роль. Классификация. Причины возникновения

1.1.1 Активирующие мутации в гене EGFR

1.2 Проблемы диагностики рака легких

1.2.1 Метод PCR Real Time

1.2.2 Зависимость выбора тактики лечения от мутаций

2. Материал и методы

2.1 Материал исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделение и оценка количества ДНК

2.2.2 Количественная PCR в реальном времени с использованием технологии ARMS и Scorpions

2.3 Методы статистической обработки данных

3. Метод PCR Real Time в диагностике мутаций EGFR

Заключение

Библиографический список

Приложение

Обозначения и сокращения

РЛ - рак легких

ПЦР, PCR - полимеразная цепная реакция

ТК - тирозин киназы

Введение

В настоящее время лабораторная диагностика занимает важное место в пропедевтике заболеваний. Большинство анализов биохимических показателей крови и других биологических жидкостей, несомненно, очень популярны сегодня и не без основания: они могут характеризовать как состояние всего организма, так и отдельных органов. Но, к сожалению, они не дают быстрого, точного и достаточно информативного ответа в ряде случаев.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ? это метод диагностики, который позволяет проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации. Кроме того, этот метод используется для получения копий непротяженных участков ДНК, специфичных для каждого генетически обусловленного признака. Исследование образцов ткани, содержащих опухоль, проводят при помощи метод PCR в реальном времени. Порог чувствительности данного метода, при использовании нами набора Therascreen всего пять процентов мутантных клеток.

Ученые-практики все чаще отмечают возрастающее количество онкологических заболеваний. В ряде опухолей обнаруживаются аномальные рецепторы эпидермального фактора роста, что обусловлено наличием активирующих мутаций в соответствующем гене.

Во всех странах мира отмечается резкое повышение частоты заболевания раком легкого. Из редкого заболевания, которым считался в прошлом столетии, рак легких превратился в одну из наиболее частых причин смерти онкологически больных людей. Ежегодно в Российской Федерации заболевают раком более 63000 человек, в том числе свыше 53000 мужчин. Более 20000, или 34,2%, выявляются в IV стадии заболевания. Несмотря на то, что уровень смертности от рака легкого в ряде стран снизился в последнее десятилетие, общее количество умерших от этого заболевания может сравниться с совокупным числом погибших от рака толстой кишки, поджелудочной и предстательной железы [Мерабишвили, Дятченко, 2000].

Уже в середине 90-х годов прошлого века стало очевидно, что химиотерапия на основе препаратов платины достигла «плато» своей эффективности. Одним из путей улучшения результатов терапии злокачественных новообразований является индивидуализация тактики лечения этих больных: с помощью определения генов-мишеней в опухолевой ткани. Наиболее изученной группой таких мишеней является семейство ростовых факторов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) [Имянитов, 2010].

Индивидуализация тактики лечения больных заключается в применении таргетных препаратов, подавляющих активность фермента эпидермального фактора роста. Эти препараты являются низкомолекулярными ингибиторами тирозинкиназ, которые блокируют АТФ-связывающий внутриклеточный домен EGFR и тем самым сигналы поступающие от этого рецептора не принимаются.

Цель исследования: оценка возможностей использования генетических маркеров опухолевой ткани при раке легких.

В связи с целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоту возникновения мутаций в гене EGFR.

2. Определить наиболее распространенный гистологический тип рака легкого при выявлении мутаций в гене EGFR.

3. Проследить влияние вдыхаемого табачного дыма на возникновения мутаций.

4. Выявить зависимость возникновения мутаций в соответствии с половой принадлежностью.

1. Аналитический обзор

1.1 Мутации и их роль. Классификация. Причины возникновения

Наследственные признаки живых организмов не являются неизменными, так как ни один механизм деления и созревания половых клеток не застрахован от ошибки, а ошибки приводят к генетическим изменениям - мутациям [mygenom.ru].

Способность мутировать - это универсальное свойство всех форм жизни от вирусов и микроорганизмов до высших растений, животных и человека. Различают два вида мутации:

1. Мутации, возникающие в половых клетках или спорах (генеративные мутации), передаются по наследству.

2. Мутации, возникающие в соматических клетках, приводят к генетическому мозаицизму, т.е. часть организма состоит из мутантных клеток, другая - из немутантных. В этих случаях мутации могут наследоваться только при вегетативном размножении с участием мутантных соматических частей организма (почек, черенков, клубней и т.п.), такие мутации могут вызывать опухолевые процессы [Жученко, 2004].

По характеру изменения генетического аппарата мутации делят на три типа:

1. Геномные мутации заключаются в изменении числа хромосом в клетках организма.

2. Хромосомные мутации. К таким мутациям относят: инверсии - участок хромосомы перевернут на 180°, так что содержащиеся в нем гены расположены в обратном порядке по сравнению с нормальным; транслокации - обмен участками двух или более негомологичных хромосом; делеции - выпадение значительного участка хромосомы; нехватки - выпадение небольшого участка хромосомы; дупликации - удвоение участка хромосомы; фрагментации - разрыв хромосомы на две части или более;

3. Генные мутации представляют собой стойкие изменения химического строения отдельных генов и, как правило, не отражаются на наблюдаемой в микроскоп морфологии хромосом [Фогель, Мотульски, 1990].

Мутацию в организме человека вызывают радиационные факторы, химические и биологические, то есть состояние окружающей среды. В зависимости от силы воздействия фактора, происходят изменения на различных уровнях организации человека (генный, клеточный и т. д.). Последствиями мутаций являются: увеличение разнообразия наследственных признаков человека, а также рост врожденных пороков, ускорение процессов старения, появление большого количества волос на теле. Человек в течение своей жизни может подвергается нескольким мутациям[www. primeinfo.net.ru].

Большинство случаев злокачественных опухолей развиваются вследствие целой серии генетических мутаций, которые происходят на протяжении жизни отдельного человека. Такие мутации называют "приобретенными", так как они не являются врожденными. Большинство приобретенных мутаций вызываются факторами окружающей среды, такими как воздействие токсинов или вызывающих рак агентов. Развивающийся в этих случаях рак носит название "спорадического". Некоторые люди могут нести в своих клетках более высокое количество врожденных мутаций, чем другие и даже в равных условиях окружающей среды, при воздействии одинакового количества токсинов, некоторые люди имеют более высокий риск развития рака [Чудов, 2002].

1.1.1 Активирующие мутации в гене EGFR

Рецептор EGF (EGFR) является продуктом одного из онкогенов семейства erb ? c-erbB1, часто называемом по аналогии с названием кодируемого белка ? геном EGFR. Рецептор имеет молекулярную массу 170 kD и состоит из длинного внеклеточ...