Исследование системы гомеостаза железа и развития окислительного стресса методами математического моделирования

Исследование системы, контролирующей гомеостаз железа и развитие окислительного стресса у млекопитающих. Экспериментальное изучение параметров, связанных с развитием окислительного стресса и метаболизмом железа, при развитии асцитной гепатомы Зайделя.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

• Оглавление
• Введение
• 1. Обзор литературы
• 1.1 Роль железа в развитии окислительного стресса
• 1.2. Система гомеостаза железа
• 1.2.1. Клеточный гомеостаз железа
• 1.2.2. Системный гомеостаз железа
• 2. Материалы и методы
• 2.1 Материалы
• 2.2 Объект исследования
• 2.3 Выделение клеток
• 2.4 Определение концентрации трансферрина в плазме крови и в асцитной жидкости опухоленосителя
• 2.5 Определение параметров окислительного стресса в крови и асците
• 2.6 Построение математической модели.
• 3. Результаты и обсуждение
• 3.1 Математическая модель клеточного гомеостаза железа
• 3.2 Математическая модель регуляции системного гомеостаза железа
• 3.3 Изучение динамики развития асцитной гепатомы Зайделя.
• 3.4 Идентификация генов, участвующих в гомеостазе железа.
• Выводы
• Список литературы

Введение

В постгеномную эру основной задачей системной биологии является исследование принципов организации и функционирования сложных молекулярно-генетических сетей, обеспечивающих формирование фенотипических (молекулярных, биохимических, физиологических, морфологических, поведенческих и др.) характеристик организмов. Развитие высокоэффективных методов молекулярной биологии привело к накоплению огромного числа экспериментальных данных по структурно-функциональной организации генных сетей и их молекулярно-генетических компонент. Анализ этих экспериментальных данных принципиально невозможен без использования современных информационных технологий и эффективных математических методов анализа данных и моделирования биологических систем и процессов. Это необходимо для понимания принципов их организации, молекулярных механизмов функционирования, закономерностей эволюции, оценки влияния мутаций на функцию генных сетей. Таким образом, теоретическое исследование динамики генных сетей методами математического моделирования приобретает в настоящее время фундаментальное и первоочередное значение.

Целью данной работы было исследование системы, контролирующей гомеостаз железа и развитие окислительного стресса у млекопитающих. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание формального описания и математической модели системы клеточного гомеостаза железа.

2. Создание формального описания и математической модели системы, контролирующей гомеостаз железа организма в целом в норме и при развитии окислительного стресса.

3. Изучение с помощью численных методов динамики системы, контролирующей гомеостаз железа и развитие окислительного стресса.

4. Экспериментальное изучение динамики параметров, связанных с развитием окислительного стресса и метаболизмом железа, при развитии асцитной гепатомы Зайделя.

Математическая модель, созданная в ходе данной работы, будет полезна для исследования системы гомеостаза железа у млекопитающих в норме и при патологии, а также процесса доставки лекарств, в частности, в ходе химиотерапии.

1. Обзор литературы

1.1 Роль железа в развитии окислительного стресса

Уникальная способность железа изменять своё состояние окисления и окислительно-восстановительный потенциал в ответ на смену состава окружающих лигандов делает этот металл необходимым почти всем живым существам. Железо легко вступает в одноэлектронные окислительно-восстановительные реакции, переходя при этом между Fe²⁺ и Fe³⁺ состояниями. Железосодержащие белки являются ключевыми компонентами многих биологических процессов, таких как энергетический обмен, транспорт кислорода, репликация и репарация ДНК, нейтрализация активных форм кислорода и многих других, катализируемых ферментами оксигеназами, пероксигеназами и.т.п. Однако те же самые химические свойства железа делают его опасным для организма. Даже малое количество “свободного” железа может катализировать образование высокотоксичных радикалов посредством цикла реакций Фентон/Хабер-Вейса. В присутствии перекиси водорода железо катализирует образование гидроксил радикалов (уравнение 1) - реакция Фентона. Далее окисленный металл может быть восстановлен супероксид радикалом (уравнение 2). Суммарная реакция называется реакцией Хабер-Вейса (уравнение 3). Она может происходить и в отсутствии переходных металлов, но присутствие железа значительно увеличивает скорость реакции [1]. Взаимодействие гидроксил радикала с компонентами клетки может приводить к окислению белков, липидов, липопротеинов, нуклеиновых кислот, углеводов.

Fe²⁺ + H₂O₂ Fe³⁺+ ^-OH + ^*OH (уравнение 1),

Fe³⁺ + O₂^*- Fe²⁺ + O₂ (уравнение 2),

H₂O₂ + O₂^{*- -}OH + ^*OH + O₂ (уравнение 3).

Так как “свободное” железо опасно, но в тоже время жизненно необходимо для организма, существует система, контролирующая его уровень. В нормальном состоянии доля железа, доступного для продукции свободных радикалов, составляет 3-5% от общего количества железа клетки. Эта часть также называется хелатируемым железом (chelatable iron) или лабильным пулом железа(labile iron pool). Лабильный пул железа содержит обе ионные формы железа (Fe²⁺ и Fe³⁺), связанные с низкой аффинностью с лигандами разной природы: цитратом, фосфатом, углеводами и карбоксилатами, нуклеотидами, нуклеозидами, полипептидами и фосфолипидами [2,3].

1.2 Система гомеостаза железа

Систему гомеостаза железа в организме можно разделить на два основных уровня организации: клеточный гомеостаз, включающий в себя процессы, происходящие на уровне клетки, и системный, охватывающий процессы, происходящие в организме в целом. Оба уровня характеризуются определенным набором белков, веществ и констант реакций, описывающих кинетику их взаимодействий.

1.2.1 Клеточный гомеостаз железа

Клеточный гомеостаз железа опосредуется процессами транспорта железа в клетку, его запасания, внутриклеточного перераспределения и экспорта из клетки в интерстиций и циркуляторное русло. На Рис. 1 представлена схема поддержания клеточного гомеостаза железа.



Рисунок 1. Схема поддержания клеточного гомеостаза железа. Комплекс трансферрина с Fe³⁺ связывается с TfR1 и TfR2 на поверхности клеточной мембраны. Эти комплексы подвергаются эндоцитозу. Кислая среда эндосом приводит к диссоциации Fe³⁺ от трансферрина. Fe³⁺ восстанавливается редуктазой Steap3 перед тем как транспортироваться из эндосом посредством DMT1(divalent metal transporter 1). Рецепторы и их комплексы с трансферрином возвращаются на клеточную мембрану, где могут вступать в новый цикл эндоцитоза. DMT1 также находится на апикальной мембране энтероцитов, где транспортирует в клетку Fe²⁺, восстановленный редуктазой DCYTB. Железо, поступившее в клетку входит во внутриклеточный лабильный пул железа. Белки IRP реагируют на изменение количества железа в этом пуле и регулируют трансляцию мРНК, содержащих IRE в 5'-UTR (H- и L-ферритин, eALAS, m-aconitase, ferroportin), и стабильность мРНК, содержащих IRE в 3'-UTR (TfR1 и DMT1) (взято из [16]).

Потребление железа клетками

Клетки млекопитающих способны получать железо из плазмы крови, где, в нормальном состоянии, большая часть железа находится в комплексе с трансферрином. Большинство клеток способно получать железо из этого комплекса посредством рецептор-индуцируемого эндоцитоза (рецепторы TfR1 и TfR2). Однако, для некоторых типов клеток, таких как гепатоциты, клетки меланомы, характерен дополнительный, трансферрин-независимый путь потребления железа. Гепатоциты способны получать железо из комплекса с ферритином, гем-гемопексином, гемоглобин-гаптоглобином также посредством рецептор-индуцируемого эндоцитоза [4, 5]. Альтернативная система потребления железа, имеющая место в эпителиальных клетках, представлена белком липокалином и его рецептором [6].

Транспорт железа в клетку посредством трансферринового рецептора 1 (TfR1) изучен лучше, чем процессы, связанные с TfR2. Трансферрин - гликопротеид, содержащийся в большом количестве в плазме крови и с высокой аффиностью связывающий две молекулы Fe³⁺. При внеклеточном pH~7.4 холотрансферрин (трансферрин, связанный с двумя молекулами железа) способен быстро связываться с TfR1. Более высокое сродство холотрансферрина к TfR1 приводит к вытеснению апотрансферрина (не связанного с железом трансферрина) из комплекса с рецептором [7]. TfR1 рецептор-индуцируемый эндоцитоз происходит в окаймленных ямках - специальных структурных образованиях на плазматической мембране. Следует заметить, что TfR1 конститутивно концентрируется в окаймленных ямках и подвергается эндоцитозу даже в отсутствие лиганда [8]. Вследствие инвагинации окаймленной ямки внутрь клетки формируется окаймленный пузырек, который быстро теряет клатриновую оболочку и превращается в эндоцитозный пузырек. Он, в свою очередь, сливается с ранними эндосомами, где поддерживается низкий pH за счет работы протонных...