Загальна біотехнологія

Оптимізація складу живильних середовищ для культивування продуцентів біологічно активних речовин, способи культивування. Мікробіологічний контроль ефективності методів стерилізації. Методи очищення кінцевих продуктів біотехнологічних виробництв.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

Размещено на

Вступ

Дисципліна «Загальна біотехнологія» є дисципліною бакалаврської підготовки фахівців-біотехнологів, належить до циклу професійної і практичної підготовки, що призначена надати базові знання з технологічного втілення процесів біосинтезу та отримання цінних речовин з використанням мікроорганізмів і інших біологічних об'єктів.

Дана дисципліна є однією з найбільш визначальних у підготовці майбутнього біотехнолога, що допомагає інтегрувати знання, отримані при вивченні таких дисциплін як «Загальна мікробіологія і вірусологія», «Біологія клітини», «Загальна біохімія», «Процеси та апарати біотехнологічних виробництв» і втілити їх у практичній діяльності.

Предметом навчальної дисципліни «Загальна біотехнологія» є вивчення технологій виробництва біологічно-активних речовин або мікробних мас за допомогою біологічних агентів із застосуванням наукових та інженерних методів, опанування основ кінетики фізіологічних перетворень, вивчення методів моделювання клітинних популяцій. У рамках дисципліни розглядаються базові технології, які застосовуються у різноманітних напрямках біотехнології та медицини.

Метою дисципліни є вивчення умов і особливостей культивування біологічних агентів (БА) - продуцентів біологічно-активних речовин (БАР), процесів біосинтезу цільового продукту, методів керування процесами біосинтезу, способів і прийомів промислової реалізації біотехнологічного процесу, а також ознайомлення студентів із принципами розробки біотехнології.

культивування біологічна активна речовина

Лабораторна робота №1

Тема: Оптимізація складу живильних середовищ для культивування промислових штамів - продуцентів біологічно активних речовин.

Мета: Оптимізація якісного і кількісного складу середовища для зростання дріжджів роду Saccharomyces.

Матеріали, реактиви та обладнання: чиста (або накопичувальна) культура Saccharomyces cerevisiae, глюкоза, пептон, сульфат амонію, сахароза, мальтоза, лактоза, агар, МПА, пивне сусло, чашки Петрі, піпетки на 1-2 мл, бактеріологічна петля, тонке предметне та покривне скло, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, розчини метиленового синього (1:40), фуксину основного, генціанвіолету, імерсійне масло, бензин, серветки, фільтрувальний папір, дезінфікуючий розчин, дистильована вода.

Оптимізація біологічного процесу зводиться до експериментального визначення умов, за яких вихід процесу (накопичення біомаси або якого-небудь продукту життєдіяльності) досягає максимального значення. Умови протікання процесу визначаються комплексом чинників, від яких залежить його вихід.

При оптимізації процесу культивування мікроорганізму покращують склад живильного середовища і умови культивування мікроорганізмів: температуру, рН, перемішування, освітлення, аерацію та ін.

Оптимізацію можна проводити за усією сукупністю чинників, що впливають на вихід процесу за допомогою математичного планування експерименту. Це достатньо трудомістке дослідження. На практиці часто доводиться стикатися з більш вузьким завданням підбору оптимального складу середовищ за заданих умов культивування, тобто при постійному рівні решти чинників. З фізіологічних відомостей можна вивести загальну форму залежності врожаю культури від концентрацій кожного окремого компонента середовища. Вид цієї залежності надано на рисунку.



Відрізок АВ відповідає області концентрацій, що лімітують урожай культури («лімітуюча область»); відрізок ВС - області, в межах якої зміна концентрації даного компонента не викликає помітної зміни урожаю («стаціонарна область»); відрізок CD - області, в якій зростання культури пригнічується надмірною концентрацією компонента («інгібіруюча область»). Для різних компонентів загальний вид залежності буде зберігатися, але набуває індивідуальних особливостей, що виражаються в різному нахилі і кривизні ділянок АВ і CD, протяжності ділянки ВС. Розглянутий вид залежності визначає вплив одного чинника на врожай культури. Проте при складанні середовищ, що є сукупністю багатьох компонентів, потрібно враховувати ефект їх сумісного впливу на величину врожаю. Вибір критерію оптимізації визначається конкретними вимогами завдання. Величина критерію оптимізації, тобто «вихід процесу» може бути виражений різними одиницями (оптичною щільністю суспензії, числом клітин, сухою масою і т.д.). В усякому разі, критерій оптимізації повинен бути безперервною чисельною величиною в усьому інтервалі існування біологічної системи, виміряти яку дослідник може за допомогою наявних у його розпорядженні засобів (приладів). Важливим моментом є вибір тривалості досліджуваного процесу, оскільки вона впливає на вихід процесу. Проте, оскільки максимальна біомаса для екстенсивної культури накопичується в стаціонарну фазу, для якої характерна відсутність зміни біомаси в часі, представляється можливим заздалегідь призначити час досліду, відповідний цій фазі. Практичне вирішення даної задачі полегшується тим, що тривалість стаціонарної фази для більшості відомих культур мікроорганізмів порівняно велика.

При підборі середовища для культури, що оптимізується, необхідно вибрати найбільш відповідні форми хімічних сполук, в яких присутні, перш за все, біогенні елементи (С, N, P, S), а також макро- і мікроелементи. Особливо важко це зробити по відношенню до азоту (що використовується у вигляді NO₃, NH₄⁺, R-NH₂, NO₂, N₂ і т.д.) і вуглецю (хімічна форма якого визначає фізіологічний тип живлення мікроорганізмів, - авто - або гетеротрофія). Як відомо, багато організмів здатні використовувати велике число хімічно різнорідних джерел вуглецю та азоту, причому частина з них залучається до процесів метаболізму одночасно і незалежно один від одного. Це дає підставу іноді включати до складу середовища декілька різних сполук вуглецю.

Таким чином, першим етапом вибору оптимального складу середовища являється якісний відбір необхідних для даної культури хімічних форм біогенних елементів. Вирішення цієї задачі може бути значно полегшено наявністю апріорних відомостей про культуру, що вивчається. В основу складу середовища, що оптимізується, може покладатися раніше відомий для цієї культури склад середовища, до якого повинні бути додані речовини, що надають позитивний ефект на зростання культури.

Наступним етапом є кількісна оцінка впливу відібраних компонентів на врожай досліджуваної культури. З числа компонентів середовища виділяють тільки ті, зміна концентрацій яких найсильніше позначається на врожаї, що дозволяє провести ранжування компонентів відповідно до міри їх впливу на врожай культури.

Хлібопекарські дріжджі роду Saccharomyces cerevisiae являють собою біомасу дріжджових клітин, що містять багатий комплекс біологічно активних речовин та володіють ферментативною активністю, яка забезпечує інтенсивне зброджування цукрів борошна і розпушування тіста. Дріжджі багаті вітамінами (рибофлавін, ергостерин, пантотенова, нікотинова та фолієва кислоти) і тому являються цінним продуктом для вітамінізації хлібобулочних виробів. У зв'язку з цим, хлібопекарські дріжджі роду Saccharomyces cerevisiae було обрано об'єктом дослідження для оптимізації складу поживних середовищ для культивування промислових штамів - продуцентів біологічно активних речовин.

Дріжджі - це одноядерні клітини (відносно мікроорганізмів мають великі розміри) еукаріотичної будови, відносяться до сімейства грибів (мікроскопічні), але не мають здатності утворювати гіфи, характеризуються хемогетеротрофним типом живлення, являються факультативними анаеробами та мезофільними організмами, розмножуються брунькуванням або діленням.

Дріжджі не зброджують полісахариди (крохмаль, клітковину), тому для їх культивування треба застосовувати моносахариди або проводити попередню обробку сировини (зазвичай рослинної) амілолітичними та іншими ферментами для оцукрювання полісахаридів живильного середовища до простих моносахаридів - глюкози. Оптимальним середовищем для культивування дріжджів є середовище Сабуро - живильне середовище для грибів: складається з 2%-го агарового гелю, 1%-го пептону, 4%-ї мальтози, рН 6,5-7. Стерилізують дане середовище протягом 15 хв при 120°С. Для зберігання грибів застосовують «середовище зберігання», аналогічного складу, але без додавання вуглеводу.

Порядок виконання роботи

Робота проводиться за трьома етапами.

На першому занятті:

1. Для з'ясування здатності культури дріжджів розвиватися на середовищах з різними цукрами приготувати 200 мл середовища наступного складу (г/100 мл): пептон - 0,2; КН₂РО₄ - 0,25, вода водопровідна. Розлити середовище в 5 колб по 60 мл у кожну. У 1-у колбу додати глюкозу, у 2-у - лактозу, у 3-у - мальтозу, у 4-у - сахарозу. Цукри додавати в концентрації 2%. Середовище в 5-ій колбі - контрольне, тобто не містить джерела вуглецю. Всі приготовані середовища розлити по 20 мл у 10 мікробіологічних пробірок (по 2 пробірки на кожен варіант). Заздалегідь у кожну пробірку внести поплавець запаяним кінцем догори. Поплавець повинен бути цілком заповнений середовищем. Пробірки з середовищами віддати на стерилізацію при 0,5 атм.

2. Приготувати середовище для з'ясування аерації на зростання дріжджів. Для цього в дві однакові високі вузькі пробірки і дві однакові конічні колби налити один і той же об'єм пивного сусла (8°Б) або сер...