Люминесценция и её применение

Анализ феномена люминесценции. Характеристика метода простого флуорохромирования. Рассмотрение основных способов диагностического применения флуоресцирующих антител: прямой, непрямой. Особенности люминесцентного окрашивания препаратов, этапы подготовки.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

Методы люминесцентной вирусологии

люминесценция флуорохромирование антитело



Сущность явления люминесценции заключается в способности некоторых веществ светиться под воздействием различных видов энергии.

Для возбуждения люминесцентного свечения многих веществ чаще используют ультрафиолетовый участок спектра света, однако в ряде случаев применяют и видимую часть, прилегающую к ультрафиолетовой области.

При люминесцентном анализе следует иметь в виду одну закономерность, именуемую правилом Стокса: спектр излучения люминесцирующих веществ сдвинут по отношению к спектру возбуждающего источника в сторону более длинных волн. Следовательно, у веществ, поглощающих ультрафиолетовый свет, флуоресценция может быть любого цвета, но вещества, флуоресценция которых возбуждается синим светом, не могут светиться фиолетовым, а только зелёным, жёлтым или красным. Надо помнить не менее важное обстоятельство - выход флуоресценции. Понятие выхода флуоресценции было введено С.И. Вавиловым и выражает отношение энергии излучения к энергии, поглощенной люминесцирующим веществом. Выход флуоресценции зависит от различных условий: температуры, концентрации вещества и т.п. Так, многие органические соединения в кристаллическом состоянии не флуоресцируют, но очень сильно флуоресцируют в растворах. При этом нет прямой зависимости между концентрацией вещества в растворе и степенью флуоресценции. Как правило, более концентрированные растворы дают меньшую флуоресценцию, чем разведенные.

Для каждого флуоресцирующего соеденения существует оптимальная концентрация его в растворе, при которой оно флуоресцирует в наибольшей степени.

В биологии использование феномена люминесценции развивалось в 2 направлениях.

1. Изучение собственной, т.е. первичной, люминесценции тканей животных, растений, микробов… Этот способ применяют при диагностике некоторых заболеваний, в частности грибковых, при определении степени и характера порчи мясных, рыбных и овощных продуктов.

2. Изучение вторичной, т.е. извне привнесённой, люминесценции. Для этого препараты окрашивают флуоресцирующими красителями -флуорохромами.

Флуорохромы обычно применяют в больших разведениях, что позволяет осуществлять прижизненную окраску исследуемых объектов.

Для люминесцентного окрашивания препаратов предложены флуоресцеин, родамин, акридиновый оранжевый, акридиновый жёлтый, аурамин, корифосфин, примулин.

Перед окрашиванием флуорохромами препараты фиксируют. Для этого их предварительно высушивают при 18-22⁰ или в термостате (37⁰) и на 10-15 минут помещают в фиксирующую жидкость. Фиксированные препараты высушивают и наносят на них раствор флуорохрома.

Наибольший интерес представляет акридиновый оранжевый, который, взаимодействуя с составными компонентами клеток, вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует жёлто-зелёным цветом, а рибонуклеиновая кислота - рубиново-красным. Акридиновый оранжевый можно применять для прижизненной окраски с целью изучения динамики изменений внутриклеточных нуклеиновых кислот.

Выявление нуклеиновых кислот люминесцентным методом в большинстве согласуется с данными, полученными при использовании других методов, применяемых в гистохимии.

Специфичность окраски акридиновым оранжевым следует проверять в контрольных опытах путём обработки препаратов соответствующими ферментами -дезоксирибонуклеазой и рибонуклеазой.

Метод простого флуорохромирования не сложен, но в большинстве случаев он не даёт возможности полно дифференцировать возбудителя заболевания.

Люминесцентное иммунохимическое обнаружение микробов, вирусов, антигенов основанона том, что антитела, будучи соединены аминным или карбоксильными группами с флуоресцирующим красителем, сохраняют способность вступать в специфическую связь с антигеном, образуя при этом комплекс антиген-антитело. Благодаря присутствию в таком комплексе флуорохрома эта связь может быть обнаружена при люминесцентной микроскопии.

Преимущество метода по сравнению с обычными серологическими реакциями заключается в значительном сокращении срока исследования. Нет необходимости в большом количестве антигена или в получении его в чистом виде. Использование адсорбированных, хорошо титрованных сывороток позволяет с большой точностью идентифицировать антигены.

Флуоресцирующие сыворотки (антитела) применяют для индикации вирусов в патологическом материале, выделениях больных животных.

Существует два основных способа диагностического применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой.

Прямой метод. Для обнаружения антигенов используют флуоресцирующие антитела, приготовленные из специфических иммунных сывороток.

Непрямой (двухступенчатый) метод. Вначале антиген обрабатывают обычной нефлуорецирующей диагностической сывороткой. Если антитела сыворотки гомологичны антигену, то они вступят с ним в связь. Для обнаружения этой связи применяют флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного- продуцента диагностической сыворотки. Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя животных глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами диагностических сывороток. Наиболее часто применяют антикроличьи сыворотки, антилошадиные и сыворотки против глобулинов морских свинок.

Существует несколько модификаций непрямого метода, наибольшее внимание из которых заслуживает метод с использованием комплимента. Было доказано, что комплимент, фиксированный на первой ступени непрямого метода, может быть выявлен окрашиванием его на второй ступени флуоресцирующей сывороткой, иммунной к сыворотке, послужившей источником комплемента.

Пользуясь методом флуоресцирующих антител, лучше использовать их глобулиновые фракции. Есть много способов выделения глобулинов из сыворотки крови: высаливание сернокислым аммонием, сернокислым натрием; осаждение этиловым спиртом, риванолом. К методам наиболее щадящим молекулы белков, можно отнести препаративный электрофорез и разделение при помощи обменников.

Для люминесцентной метки сывороток или их глобулиновых фракций используют специальные флуорохромы. Наиболее распространённые - изоцианат и изотиоционатфлуоресцеина, 1-диметил-аминонафталин-5-сульфохлорид, изоцианат родамина В, изотиоцианат родамина В-200, хлорид-3-гидроокиси-5-8-10-пирен-три-сульфокислоты.

При исследовании гистологических срезов, тканевых культур, клеток большое значение имеет характер собственной флуоресценции этих объектов. Большинство тканей обладает желто-зеленым свечением. Поэтому для дифференцирования полезно использовать сыворотки, меченные соединениями родамина.

Наиболее хорошие результаты даёт мечение белков соединениями типа изотиоционатафлуоресцеина и изотиоцианата родамина В-200.

Соединение (конъюгирование) белков сывороток или их глобулиновых фракций с флуорохромами можно проводить различными способами. Для изоцианатафлуоресцеина метод разработан Кунсом и сводится к следующему.

Определяется общее количество белка сыворотки (глобулинов), подлежащей мечению. Пользуясь рефрактометром или таблицей Рейса или микрометодомКъельдаля. Зная количество белка, подлежащего мечению, составляется реакционная смесь. Общее количество смеси должно быть таким, чтобы содержание белка в ней было равно 1 проценту. В состав смеси входят : карбонат-бикорбанатный буферный раствор 0,5М, рН 9,0-15%, диаксан 15%, ацетон 7%, изоцианатфлуоресцеина 5 мг на 100 мг белка. До 100% объёма смесь доводят 0,15 М раствором хлористого натрия. Если изоцианатфлуоресцеина используют в форме раствора в смеси диаксан-ацетон, то следует соответственно уменьшить количество этих реактивов в общем количестве смеси. Обычно растворы изоцианатафлуоресцеина содержат 1 часть диоксана и 2 части ацетона.

Составные части реакционной смеси соединяют при 4⁰, постоянно помешивая, и внося каждый компонент по каплям, используя магнитную мешалку. Смесь ставят в холодильник на 16-18 часов.

Обычно используют 2 метода метки изотиоцианатомфлуоресцеина.

Метод Риггса. К охлаждённой до 0-0,5⁰ смеси, состоящей из 10 мл 0,15 М раствора хлористого натрия, 3 мл карбонат- бикарбонатного буфера, рН 9,0, и 2 мл ацетона, прибавляют 10 мл разведённого глобулина, количество белка в котором известно. При помешивании в смесь вносят по каплям 1,5 мл ацетона с растворенным в нём изотиоцианатом. На каждые 100 мг белка добавляют по 5 мг красителя. Приготовленную реакционную смесь оставляют в холоде при 4⁰ для перемешивания на магнитной мешалке на 16-20 часов.

Метод Маршала. Глобулин разводят 0,15 М раствором хлористого натрия и 0,5 М карбонат-бикарбонатным буфером, рН 9,0, так чтобы в 1 мл было 10 мг белка и 10% буфера. Краситель вносят в смесь в виде порошка из расчёта 5 мг на 100 мг белка.

В процессе конъюгации не весь краситель вступает в прочную химическую связь с белком, в результате чего из сыворотки необходимо удалить несвязанный или непрочно связанный флуорохром (диализом или колоночной хромотографией).

Диализ ведут в целлофановых мешочках или гильзах против 0,15 М раствора хлористого натрия в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2-7,4, при температуре 4⁰ в течение 5-7 дн...