Полимеразная цепная реакция, история ее изобретения и практическое использование. Преимущества ПЦР и возможные ошибки при реализации методики. Особенности ПЦР в "реальном времени". Роль и значение ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

3

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Биологический факультет

Кафедра генетики

Курсовая работа

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Измайлова Антонина Владимировна

Научный руководитель:

к.б.н., доцент Волков А.Н.

КЕМЕРОВО, 2010

Оглавление

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 История изобретения и принцип ПЦР

1.2 Преимущества ПЦР и возможные ошибки при реализации методики

1.3 Особенности ПЦР в «реальном времени»

1.4 Практическое использование ПЦР

1.5 Применение ПЦ в ветеринарии

Выводы

Литература

Размещено на

Введение

Полимеразная цепная реакция (Polymerase chain reaction), более известная как "ПЦР" (PCR) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и был удостоен Нобелевской премии. Причина достаточно проста: ПЦР делает невозможное возможным.

Благодаря своим достоинствам, метод ПЦР широко применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, в эпидемиологии, в генетике, для HLA-типирования, в судебной медицине, для определения отцовства и идентификации личности, в биотехнологии, в области сертификации пищевого сырья и продуктов питания (Малкова, 1994).

Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях (Мухина, 2002).

Диагностические возможности ПЦР не ограничены способностью микроорганизма расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (поскольку их чувствительность сопоставима), а в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях.

На сегодняшний день накоплен богатый опыт в теории и практике ПЦР. Однако наряду с успехами, связанными с внедрением ПЦР в клиникодиагностических лабораториях, нередко можно встретить недоверие к этому методу из-за ошибок, приводящих к некорректным результатам. В основном такие ошибки возникают на этапе забора материала для исследования. Так избыток слизи или гемоглобин могут вызвать ингибирование реакции, что приведет к ложноотрицательному результату.

Цель курсовой работы:

сбор и систематизация литературного материала по вопросу применения молекулярно-генетических методов для решения задач медицины и ветеринарии.

Задачи:

1. Изучение истории становления современных молекулярно- генетических методов;

2. Ознакомление с методическими аспектами различных вариантов ПЦР;

3. Характеристика направлений использования ПЦР- диагностики.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 История изобретения и принцип ПЦР

Впервые идею полимеразной цепной реакции (ПЦР) озвучил Карри Мюллис (Kary Mullis) весной 1983 года будучи сотрудником биотехнологической компании “Cetus Corporation”, расположенной в Калифорнии, США. Первая публикация, содержащая краткое описание метода ПЦР, вышла в 1985 году в Science, в данной работе метод был использован для детекции мутаций в тотальной ДНК человека для поиска мутаций, связанных с серповидноклеточной анемией. В течение двух последующих лет авторы метода опубликовали массу работ, в которых метод ПЦР был описан более подробно.

Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические.

Также появлению ПЦР много способствовало открытие уникального фермента ДНК-полимеразы (или taq-полимеразы). Именно этот фермент катализирует и «контролирует» все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента -- он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а «любимый» его температурный режим во время работы -- 72?С. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре (Бутенко, 2005).

1.2 Преимущества ПЦР и возможные ошибки при реализации методики

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов-г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-системы для ВИЧ-1 составляет 300-500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем - диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95-98%.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности - «специфичность», определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99-100%.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм (Петрова, 2000).

Проведенная в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что "быстрые" или экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60%, ИФА - 50-70%, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) - 55-75%, культуральное исследование - 60-80%, а ПЦР от 90 до 100%.

Поэтому ПЦР, по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом (Самсонова, 2004).

Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

Универсальность

Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно.

Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обуславливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

Специфичность

Высокая специфичность (100%) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР - диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

Чувствительность

Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять единичные копии в исследуемом образце.

Актуальность ответа (быстрота получения результата)

Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

Возможность доклинической и ретроспективной диагностики

ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё...