Влияние низкомолекулярной фракции кордовой крови на фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro

Сравнительное исследование влияния низкомолекулярной фракции кордовой крови и фармакологического препарата актовегина на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов трансфузионной лейкоцитарной массы и кислород-зависимых бактерицидных механизмов.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

21

Размещено на

Министерство образования и науки Украины

Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина

Биологический факультет

Кафедра физиологии человека и животных

Дипломная работа специалиста

Влияние низкомолекулярной фракции кордовой крови на фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro

студентки V курса

Остапенко Татьяны Владимировны

Научный руководитель:

к.б.н. Федосова С.Н.,

Харьков - 2009



Реферат

Работа изложена на страницах, содержит таблицы, рисунков и литературных источников.

Ключевые слова: трансфузионная лейкоцитарная масса, лейкоциты, нейтрофилы, фагоцитарная активность, низкомолекулярная фракция кордовой крови, актовегин.

В данной работе представлены результаты сравнительного исследования влияния низкомолекулярной фракции кордовой крови и фармакологического препарата актовегина на фагоцитарную активность нейтрофилов трансфузионной лейкоцитарной массы, хранившейся при +4°С. Показано, что хранение трансфузионной лейкоцитарной массы приводило к снижению всех исследуемых показателей. Инкубация лейкоцитов в среде, содержащей 0,17% раствор актовегина, способствовала восстановлению фагоцитарной активности нейтрофилов. При инкубации лейкоцитарной массы в среде содержащей различные концентрации низкомолекулярной фракции кордовой крови наблюдалось повышение активности кислород-зависимых бактерицидных механизмов. Добавление 0,017% раствора низкомолекулярной фракции кордовой крови оказывало стимулирующее влияние на поглотительную и переваривающую способность нейтрофилов.

Список сокращений

ЛМ - лейкоцитарная масса

КК - кордовая кровь

НФКК - низкомолекулярная фракция кордовой крови

ФА - фагоцитарная активность

ФИ - фагоцитарный индекс

ФЧ - фагоцитарное число

КЗФ - коэффициент завершенности фагоцитоза

НСТ - нитросиний тетразолий

ГМФШ - гексозомонофосфатный шунт

Введение

Для лечения и профилактики ряда патологических состояний широко используется лейкоцитарная масса (ЛМ) донорской крови человека. Трансфузии лейкоцитов нашли свое применение в комплексной терапии бактериальных инфекционных осложнений гемодепрессии, профилактике и терапии сахарного диабета на ранних стадиях заболевания, сепсисе, лейкопении и функциональных дефектах нейтрофилов. Положительный эффект применения лейкоконцентрата отмечается так же при тяжелых инфекциях с повторными бактериальными или грибковыми поражениями. Основным назначением к применению ЛМ служат различные нарушения фагоцитоза. В настоящее время в связи с расширением показаний к применению концентратов лейкоцитов, возникла проблема создания их запасов.

Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro приводит к выходу из-под контроля нейрогуморальных факторов. Клетки и ткани, которые живут вне организма, характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, отличных от свойств клеток и тканей in vivo. Известно, что в условиях in vitro лейкоциты быстро теряют свою функциональную активность. Сохранение жизнеспособности клеток ЛМ при положительных температурах встречают значительные трудности в связи с быстрым затуханием энергетического обмена, что, в свою очередь, связано со сложной внутренней структурой клеток. Мембраны гранул лейкоцитов весьма чувствительны к любого рода воздействиям и при нарушении их целостности, содержащиеся в гранулах гидролитические ферменты выходят в цитоплазму клетки, вызывая ее гибель. В связи с этим, целесообразным является подбор сред и условий хранения ЛМ, создания сред реинкубации лейкоцитов перед трансфузией, с целью повышения их функциональной активности.

Основным компонентом ЛМ является наиболее многочисленный тип лейкоцитов - нейтрофилы, представляющие собой систему полиморфонуклеарных фагоцитов, с расположенными в цитоплазме первичными азурофильными и вторичными специфическими гранулами. Образовавшись в костном мозге, через сосудистое русло нейтрофилы выходят в ткани, где и осуществляют свою главную функцию - поиск, захват и разрушение микроорганизмов - фагоцитоз, осуществляющийся в несколько этапов. В задачу нейтрофилов входит экстренная работа дезинфекции очага воспаления и осуществление вторичной альтерации, с целю очищения очага от микробов. При стимуляции нейтрофилы продуцируют комплекс хемокинов и провоспалительных цитокинов, активирующих другие клетки иммунной системы.

Активация энергетического обмена и теплопродукции нейтрофилов после связывания объекта фагоцитоза представляет собой метаболический взрыв. Процесс фагоцитоза связан со «вспышкой гликолиза», что выражается в повышении продукции лактата и сопровождается возрастанием синтеза липидов в мембране фагосомы. Элементом полномаштабного метаболического взрыва в нейтрофилах является активация неметохондриальных оксидаз. В ходе завершающей стадии фагоцитоза осуществляется внутриклеточный киллинг: кислород-зависимый и бескислородный. Кислорд-зависимые механизмы киллинга важнее, чем бескислородные, т.к. активны в отношении бактерий с неповрежденной клеточной стенкой.

Учитывая, что истинная активация нейтрофилов сопровождается метаболическим взрывом, многократно увеличивающим потребление энергии и увеличивающим потребность клеток в кислороде, является целесообразным использование в качестве сред инкубации препаратов, действие которых направленно на восстановление вышеуказанных процессов.

В клинической практике уже продолжительное время успешно применяются препараты, которые являются гемодиализатами, получаемыми из крови молочных телят, такие как актовегин. Этот препарат вырабатывается на основе именно безбелковой низкомолекулярной фракции крови (меньше 5 кДа), получаемой путем последовательных процессов криогемолиза, ультрафильтрации, диализа и концентрации.

Было замечено, что клетки разных клеточных и тканевых культур, а также органов людей и животных под влиянием этих препаратов увеличивают потребление кислорода и глюкозы. Этот эффект, не зависимо от самого органа, приводит к повышению энергетического статуса клетки, которая в свою очередь влияет на ее функциональный метаболизм.

В настоящее время в клинической практике все большее внимание и применение находят препараты, полученные из природного сырья. Одним из таких источников полифункциональных препаратов является кордовая кровь (КК) [8].

Известно, что КК - это мощный биогенный стимулятор, эффективность действия которого заключается в том, что она имеет в своем составе сбалансированный комплекс биологически активных веществ, антиоксидантов, гемопоэзстимулирующих факторов, которые принимают участие в индукции, репрессии, обратном ингибировании разных ферментов в клетках [5].

Учитывая, что в клинической практике уже давно успешно применяются препараты, которые по происхождению являются низкомолекулярными гемодериватами, получаемыми из других источников, является вполне целесообразным изучение биологической активности низкомолекулярных фракций (меньше 5 кДа) КК, подвергнутой криогемолизу и изучение возможности разработки и внедрения сред реинкубации на их основе [8].

Исходя из этого, целью данной работы явилось:

- сравнительное изучение влияния актовегина и НФКК на фагоцитарную активность нейтрофилов в опытах in vitro.

В связи с поставленной целью, предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. Провести сравнительное изучение ФИ,ФЧ, КЗФ и активности кислород-зависимых бактерицидных механизмов в нейтрофилах трансфузионной лейкоцитарной массы, хронившейся при +4°С.

2. Изучить влияние актовегина в концентрациях 0,017%, 0,033%, 0,17%, 033% на фагоцитарную активность нейтрофилах в опытах in vitro.

3. Изучить влияние НФКК в концентрациях 0,017%, 0,033%, 0,17%, 033% на фагоцитарную активность нейтрофилах в опытах in vitro.

4. Изучить влияние актовегина в концентрациях 0,017%, 0,033%, 0,17%, 033% на активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов в опытах in vitro.

5. Изучить влияние НФКК в концентрациях 0,017%, 0,033%, 0,17%, 033% на активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов в опытах in vitro.

1. Обзор литературы

1.1 Фагоцитарная функция нейтофилов

Фагоцитоз - основная функция нейтрофилов, состоящая из цепи событий, которая, в широком смысле, может быть подразделена на каскад миграции и каскад Киллинга.

Миграционный каскад включает:

· маргинацию,

· диапедез через сосудистую стенку,

· хемотаксис;

Каскад Киллинга включает:

· распознавание,

· прикрепление,

· рецепторный эндоцитоз (погружение),

· слияние гранул,

· дегрануляцию в фагосоме, «метаболический взрыв», бактерицидный эффект (переваривание),

· экзоцитоз.

Известно, что ключевую роль в процессе маргинации играет взаимная экспрессия а...