Общая характеристика шикимовой кислоты, ее главные физические и химические свойства, способы и методика получения, сферы практического применения. Бактериальные штаммы и плазмиды, используемые средства и реактивы, методы исследования, анализ результатов.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

Размещено на

Введение

Впервые шикимовая кислота (3,4,5-тригидрокси-1-циклогексен-1-карбоновая кислота) была выделена в 1885 году из плодов аниса - растения, произрастающее в Японии - Illicium anisatum. Японское название данного растения «Шикимино - ки», что и послужило основой для названия данной кислоты. Дальнейшие исследования данного соединения показали, что оно является промежуточным продуктом щикиматного пути у микроорганизмов и растений. Данный метаболитический путь отсутствует у животных.

Шикимовая кислота является промежуточным звеном в синтезе лигнина, ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана), убихинов, фолиевой кислоты, тетрациклина, фенольных и карболовых соединений и большинства алкалоидов растений и микроорганизмов. Используется в качестве реагента в органическом синтезе.

Также используется в качестве исходного вещества в синтезе осельтамивира (тамифлю) - противовирусного препарата, используемого в лечении гриппа; зейленона для лечения раковых заболеваний; монопальмитилоксишикимовой кислоты, обладающей анетикоагуляционной активностью при внутримышечном введении.

Производные шикимовой кислоты могут использоваться в качестве гербицидов и антибактериальных средств, так как они могут блокировать шикиматный путь у растений и бактерий не нанося вреда для животных и человека, так как у них отсутствует данный метаболитический путь.

Данная кислота может быть использована в качестве исходного соединения для синтеза ряда ароматических и хиральных соединений.

Как видно из сказанного шикимовая кислота является важным продуктом для химической промышленности, медицины, фармакологии и сельского хозяйства. Поэтому встаёт вопрос о получении большого количества данного соединения. В мировой фармацевтической промышленности существует три подхода к получению шикимовой кислоты: выделение из растительного сырья, микробиологический и химический синтез. Химический синтез является дорогостоящим методом. Синтез из растительного сырья является трудоёмким методом и не обеспечивает высокого выхода продукта. Поэтому наиболее перспективным методом является микробиологический синтез.

Цель: изучить литературу по данной проблематике и получение промежуточной конструкции, содержащей вставку, ограниченную генами tmrB и aroK, на основе плазмиды pMTL21C.

Задачи:

1) Амплифицировать фрагмент ДНК, ограниченный генами tmrB и aroK, с матриц В. Subtilis ВНИИгенетика-15 С10 и В. Subtilis ВНИИгенетика-15 D4.

2) Продукт амплификации лигировать с плазмидой pMTL21C, для получения промежуточной конструкции. Плазмиду pMTL21C предварительно подвергают рестрикционному анализу по сайту рестрикции SmaI.

3) Трансформировать полученной лигированной смесью клетки E.coli DH5б.

1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристик шикимовой кислоты

Шикимовая кислота представляет собой бесцветные игольчатые кристаллы с температурой плавления 184°С. Это соединение левовращающее и имеет удельное вращение -157°С. Для данного вещества характерен единственный максимум в ультрафиолетовом диапазоне, наблюдаемый при л = 235 нм. Для шикимовой кислоты описано несколько стериоизомеров, но биологической активностью обладает б-изомер, структура которого изображена на рис. 1.1.

шикимовый плазмида реактив бактериальный

Рисунок 1.1 - Общая структура б-изомера 3,4,5-тригидрокси-1-циклогексен-1-карбоновой кислоты

Молекула шикимовой кислоты в целом не симметрична и имеет 3 стереогенных центра, что обеспечивает возможность существования 2³=8 стереоизомеров (4 пары энантиомеров). Природная (?) - шикимовая кислота имеет (3R, 4S, 5R) - конфигурацию, семь других стереоизомеров ((3S, 4R, 5S)-, (3R, 4R, 5S)-, (3S, 4S, 5R)-, (3R, 4S, 5S)-, (3S, 4R, 5R)-, (3S, 4S, 5S) - и (3R, 4R, 5R) - шикимовые кислоты) не имеют биологического и практического значения. Рацемат из (3R, 4S, 5R) - и (3S, 4R, 5S) - шикимовых кислот имеет температуру плавления 191-192°C.

Для шикимовой кислоты характерны реакции являющиеся типовыми для соединений, содержащих карбоксильную группу, три гидроксильные группы и двойную связь. Стереохимия молекулы позволяет при соответствующих условиях протекать внутримолекулярным реакциям между карбоксильной группой и одной гидроксильной группы. Для молекулы также характерны реакции цис-транс переходов для гидроксильных групп [7].

1.2 Шикиматный путь

Шикиматный путь является общим метаболитическим путём для целого ряда организмов, приводит к образованию разнообразных ароматических соединений. Ключевым метаболитом этого пути является шикимовая кислота, которую можно использовать в качестве материала для синтеза ингибиторов нейраминидазы и препаратов, используемых в противоопухолевой терапии.

Шикиматный путь был обнаружен Бернхардом Дэвисом и Дэвидом Спринсоном как биосинтетический путь образования ароматических аминокислот фенилаланина, тирозина и триптофана. Этот путь присутствует у разных групп микроорганизмов, у растений и паразитов, но отсутствует у животных. Фенилаланин и триптофан являются важными компонентами рациона питания животных, и животные синтезируют тирозин из фенилаланина в одну стадию.

Значение шикиматного пути велико, так как этот путь является единственным установленным путём биосинтеза ряда важнейших природных соединений, в том числе значимых в плане их практического использования.

Схема шикиматного пути представлена на рисунке 2.1.



Рисунок 2.1 - Шикиматный путь

В 1935 году немецкий химик-органик Германн Отто Лауренц Фишер (1888-1960) отметил, что кислоты хинная и шикимовая могут быть метаболитически тесно связанными с бензоидными ароматическими соединениями. Подтверждения этого предположения не существовало до 1950-ых годов.

В 1950 г. американский микробиолог Бернард Дэвис (1916-1994), используя метод отбора с применением пенициллина, получил серию мутантов Escherichia coli, способных расти лишь в такой питательной среде, в которую добавлялись ароматические соединения. Многие мутанты нуждались в фенилаланине, тирозине, триптофане, парааминобензоате и парагидроксибензоате (в следовых количествах). Неожиданно оказалось, что потребность во всех пяти соединениях можно удовлетворить путем добавления шикимовой кислоты (шикимата), в то время считавшимся редким соединением, встречающимся лишь у некоторых растений.

Таким образом, шикимат оказался промежуточным продуктом в процессах биосинтеза трёх ароматических протеиногенных аминокислот, парааминобензоата и других существенных ароматических соединений.

При помощи ауксотрофных мутантов Escherichia coli, Aerobacter aerogenes и Neurospora и с применением изотопно-меченых соединений был прослежен весь путь от углеводных предшественников до первичных и вторичных метаболитов ароматической природы. Важнейшая часть работы была проделана Бернардом Дэвисом в сотрудничестве с Дэвидом Спринсоном (1910-2007) из Колумбийского университета. Значительный вклад в изучение отдельных стадий процесса внесли также австралийцы Франк Гибсон (1923-2008), Джеймс Питтард и многие другие исследователи.

Дэвис и Спринсон установили путь через ДАГФ, долго считавшийся единственным. В 2004 году американский биохимик Роберт Вайт опубликовал результаты своих исследований по рассшифровке пути через ДКФФ. Однако предложенная Вайтом гипотетическая схема биосинтеза ДКФФ в последствии не подтвердилась. В 2006 году Роберт Вайт и Хуимин Ксу сообщили, что им удалось выяснить истинный путь биосинтеза ДКФФ у Methanocaldococcus jannaschii.

Шикиматный путь у бактерий используется исключительно для синтеза ароматических аминокислот. Высшие растения используют эти аминокислоты не только в качестве строительных элементов белка, но и как предшественников вторичных метаболитов [9].

Ферменты шикиматного пути у микроорганизмов находятся в цитоплазме, у растений в пластидах [3].

Шикиматный путь включает в себя 7 каталитических реакций и сочетает обмен углеводов с синтезом ароматических аминокислот. В результате первых четырёх реакций происходит образование шикимовой кислоты, а следующие три реакции обеспечивают ее дальнейшее преобразование в хоризмовую кислоту. Хоризмовая кислота является предшественником многих ароматических соединений, фолиевой кислоты, убихинона [3].

Путь биосинтеза ароматических соединений схож в клетках бактерий, паразитов и растений. Наблюдаемые различия относятся к структуре ферментов и способа их регулирования.

Первым идентифицированным метаболитом данного пути была шикимовая кислота, которая и дала ему данное название. Так как шикиматный путь в дальнейшем приводит к образованию различных ароматических соединений, его часто называют общим путём биосинтеза ароматических соединений. Однако Бентли считает такое название не очень корректным, так как не все ароматические соединения образуются по данному пути [12], [13].

Протекание всех реакций катализируется определёнными ферментами, ферменты являются продуктами соответствующих генов. Гены шикиматного пути у бактерий обозначаются aro (от англ. Aromatic - аромати...