Влияние восстановленного глутатиона и ингибитора каталазы на пероксидную резистентность и скорость лизиса эритроцитов при действии хлорида железа

Механизмы пероксидного гемолиза. Изучение влияния хлорида железа на пероксидную резистентность и скорость лизиса эритроцитов человека в условиях ингибирования каталазной активности и повышения содержания восстановленного глутатиона в опытах in vitro.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

Размещено на

Министерство науки и образования Украины

Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина

Биологический факультет

Кафедра биохимии

Дипломная работа магистра на тему

Влияние восстановленного глутатиона и ингибитора каталазы на пероксидную резистентность и скорость лизиса эритроцитов при действии хлорида железа

Харьков 2010 г.

РЕФЕРАТ

Работа изложена на 39 страницах, содержит 6 таблиц и 7 рисунков, 42 литературных источника (из них 32 иностранных).

Объект исследования - эритроциты человека из донорской эритромассы (ХОЦСК, кровь (мужская) группы А(II), Rh+, консервант - глюгицир).

Ключевые слова: гемолиз, эритроциты, пероксидная резистентность, кинетика, каталаза, азид натрия, хлорид железа (III) , глутатион.

Целью работы являлось изучение активности каталазы, пероксидного гемолиза эритроцитов и кинетики гемолиза после обработки эритроцитов хлоридом железа (III), азидом натрия, глутатионом.

Установлено, что при ингибировании каталазной активности азидом натрия, в том числе при действии хлорида железа скорость гемолиза эритроцитов возрастает. Хлорид железа (III) в концентрации 0,5% вызывал полный лизис эритроцитов человека за 5 мин инкубации с максимумом лизиса от 1,5 до 3,5 минут инкубации вне зависимости от предварительной обработки эритроцитов. Предварительная обработка азидом натрия увеличивала скорость гемолиза в присутствии 0,5% FeCl3. Последовательная предварительная обработка эритроцитов азидом натрия или глутатионом и далее 0,05% FeCl3 вызывала снижение скорости лизиса эритроцитов хлоридом железа.

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ

GSH - восстановленный глутатион

FeCl3 - хлорид железа (III)

СОД- супероксиддисмутаза

NaN3 - азид натрия

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время установлено, что внутрисосудистый лизис эритроцитов при патологиях и действии стрессорных факторов вызывает развитие сосудистых повреждений за счет накопления в крови гем- и железо-содержащих продуктов гемолиза. Высвободившиеся из гема ионы Fe3+ увеличивают выработку активных форм кислорода, которые способны индуцировать адгезию клеток крови к стенкам сосудов и вызывать окисление липопротеинов низкой плотности. Из литературных данных известно, что содержание железа в окисленной форме коррелирует с риском сердечнососудистых заболеваний, что обуславливает постоянный научный интерес к изучению факторов, отвечающих за устойчивость эритроцитов к гемолизу. Особую актуальность приобретает изучение пероксидной резистентности клеток крови, т.к. повышенное содержание перекиси водорода в кровяном русле отмечается при различных патологических состояниях, в том числе инфекциях и воспалении.

Учитывая прооксидантный характер действия ионов железа на мембраны клеток, можно предположить ключевую роль антиоксидантных систем в защите эритроцитов от лизиса. Вместе с тем, механизмы гемолитического действия соединений железа, а также роль каталазы и восстановленного глутатиона, как ключевых компонентов антиоксидантной защиты, в поддержании пероксидной резистентности эритроцитов остаются малоизученными. В связи с вышесказанным, целью настоящей работы являлось изучение влияния хлорида железа (ІІІ) на пероксидную резистентность и скорость лизиса эритроцитов человека в условиях ингибирования каталазной активности и повышения содержания восстановленного глутатиона в опытах in vitro.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 МЕХАНИЗМЫ ПЕРОКСИДНОГО ГЕМОЛИЗА

Перекись водорода - одна из активных форм кислорода, которая способна вызывать гемолиз эритроцитов. При этом лизис клеток может осуществляться как при действии экзогенной перекиси водорода, так и эндогенной, выработавшейся в клетке в избыточных количествах. Генерация перекиси водорода может наблюдаться при различных процессах, таких как действие гормонов, гипероксия, инфекционные заболевания. Основными клеточными мишенями являются липиды и белки мембраны эритроцита, а также внутриклеточный белковый компонент.

1.1.1 Влияние перекиси водорода на липидный компонент мембраны эритроцита

Одной из причин гемолиза эритроцитов при влиянии перекиси водорода является перекисное окисление липидов мембраны. Непосредственными эндогенными предшественниками гидроксильного радикала, инициирующего цепное окисление липидов, служат ионы двухвалентного железа гемоглобина и перекись водорода (реакция Фентона)[1]. При недостатке витамина Е и внесении Н2О2 наблюдается перекисное окисление фосфолипидов мембраны и последующий гемолиз по коллоидно-осмотическому типу. Наиболее чувствительной к окислению фракцией липидов в данном случае является фосфатидилэтаноламин,

Перекись водорода служит инициатором перекисного процесса, в результате ее превращений образуются свободные радикалы, которые инициируют перекисное окисление липидов по типу цепной реакции [2]. Под влиянием эндогенной перекиси водорода в результате аутокаталитических реакций также образуются перекиси и гидроперекиси липидов.

1.1.2 Влияние перекиси водорода на белковый компонент мембран

Гемолиз эритроцитов под влиянием перекиси водорода может быть следствием не только повреждения липидного компонента мембран. Окисление сульфгидрильных групп белков мембраны может также приводить к лизису красных кровяных клеток.[3] , [4]

При этом эндогенная перекись, повреждающая белковые структуры может образовываться в результате действия на эритроцит органических перекисей Повреждение сульфгидрильных групп гемоглобина при атаке гидроксильного радикала может лежать в основе денатурации гемоглобина. В дальнейшем, потерявший нативную структуру гемоглобин может связываться со спектриновой сетью, обуславливая ее повреждение и последующий гемолиз [5],[6]. При этом пероксид водорода может быть результатом окислительно-восстановительных превращений фенилгидразина. Фенилгидразин является прооксидантом, метаболизируется в организме с образованием фенилдиазина, при этом генерируются свободные радикалы, в том числе перекись водорода [7], [8]

Гемоглобин может действовать как ловушка (scavenger) для пероксида водорода, при этом ион железа гемоглобина Fe (II) окисляется до Fe (III) и даже до Fe (IV) с образованием соответственно таких форм гемоглобина как метгемоглобин и феррил гемоглобин. Молекулы феррил гемоглобина и радикалы гемоглобина могут полимеризоваться, что в последующем ведет к гемолизу. При этом повышенное содержание перекиси водорода в кровяном русле в физиологических условиях может наблюдаться при активности нейтрофилов в воспалительных процессах. Под влиянием перекиси водорода могут образовываться не только метгемоглобин и феррил гемоглобин, но и временно существующие белковые радикалы гемоглобина и гем-белковые сшивки.

Также было показано, что при обработке гемоглобина перекисью водорода этот белок становится более чувствительным к действию протеиназ (трипсина, химотрипсина, эластазы и др.) [9]. Интенсивный гемолиз наблюдается при обработке эритроцитов новорожденных перекисью водорода. Это объясняется пониженной активностью метгемоглобинредуктазы, каталазы и низким содержанием витамина Е в эритроцитах. [10]

Добавление экзогенной перекиси, либо внутриклеточное ее образование в ответ на рецепторную стимуляцию влияет на функции различных белков, включая протеинкиназы, протеинфосфатазы, транскрипционные факторы, фосфолипазы, ионные каналы и G-белки. Т.к. перекись водорода является небольшой, способной к диффузии молекулой, которая может легко синтезироваться и разлагаться в ответ на внеклеточные стимулы, то она, таким образом, соответствует всем требованиям, предъявляемым к внутриклеточным вторичным посредникам при передаче сигнала. И на данный момент перекись водорода рассматривается как вторичный посредник при токсических условиях. [11]

1.2 АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА ЭРИТРОЦИТОВ

1.2.1 Антиоксидантные ферменты

Одну из первых линий защиты клеток от агрессивного действия свободных радикалов обеспечивают ферменты - супероксид-дисмутаза (СОД), каталаза, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы, удаляющие органические перекиси.

Супероксиддисмутаза

Различаясь по строению активного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД (металлоферменты) катализируют одну и ту же реакцию дисмутации:

*ОО - +*ОО - + 2Н+ > О2 + НООН

Судьба перекиси водорода, образуемой в процессе реакций дисмутации, различна. Частично перекись водорода разлагается при участии каталазы, проявляющей активность почти во всех клетках организма человека, особенно в печени, почках, эритроцитах:

2Н2О2 > Н2О + О2

В присутствии ионов двухвалентного железа перекись разлагается в реакции Фентона с образованием гидроксильного радикала (OH*):

Н2О2 + Fe2+ > Fe3+ + OH- + OH*

Fe3+ + H2O2 > Fe2+ + OOH· + H+

Радикалы гидроксила чрезвычайно активны и разрушают различные по структуре молекулы.

СОД существенно ускоряет дисмутацию супероксид анион-радикала. Однако, несмотря на высокую специфичность фермента, при определенных условиях Cu-Zn СОД может взаимодействовать с перекисью водорода и выступать в качестве прооксиданта.

Исключительно важным моментом эффективности ферментного звена ан...