Методологія генетичної трансформації рослин

Цілі та етапи трансформації рослин. Основні методи та напрями створення генетично модифікованих сільськогосподарських культур. Основні етапи агробактеріальної трансформації рослин. Гени-маркери для відбору трансформантів та регенерація трансформантів.
Краткое сожержание материала:

Размещено на

Контрольна робота

Методологія генетичної трансформації рослин

Вміст

1. Цілі та етапи трансформації рослин

2. Векторні системи для переносу генів

3. Методи переносу генів в рослину

3.1. Основні етапи агробактеріальної трансформації рослин

4. Гени-маркери для відбору трансформантів та регенерація трансформантів

Література

Вступ

Одним із шляхів підвищення продуктивності сільського господарства, і зокрема рослинництва, є максимальне використання біологічного потенціалу сільськогосподарських культур. Великі надії в цьому напрямі покладають на використання досягнень генетичної інженерії - як комплексу підходів та методів, що дозволяють вносити спрямовані зміни в геном рослин.

Генетична трансформація - це спрямована модифікація геному рослинної клітини очищеною чи рекомбінантною ДНК з клітин іншого організму, яка інтегрується в геном модифікованої (реципієнтної) клітини.

1. Цілі та етапи трансформації рослин

В загальному вигляді процес трансформації складається з наступних етапів:

· виділення послідовності генів, що відповідають за ознаку, яку необхідно надати реципієнтній клітині;

· вбудовування цільового гену в спеціально сконструйовану молекулу ДНК - так званий вектор;

· перенесення вектору в рослинну клітину, де відбувається інтеграція цільового гену в геном клітини;

· відбір на спеціальних середовищах трансформованих клітин;

· регенерація трансгенних рослин.

Напрями створення трансгенних рослин:

· створення рослин з покращеними споживчими характеристиками;

· створення рослин, стійких до гербіцидів;

· створення рослин, стійких до абіотичних стресів (посуха, засолені ґрунти);

· створення рослин, стійких до шкідників та збудників хвороб (рис. 1).

Отримання таких традиційних продуктів, як вуглеводи (цукор, крохмаль), ліпіди (різні олії) та білки в звичайних та трансгенних рослинах, що застосовуються для їжі, для годівлі худоби, у промисловості, також є економічно вигідним, що підтверджується щорічним збором мільйонів тон урожаю із сільськогосподарських угідь. У цьому зв'язку широко ведуться дослідження з метою удосконалення якісних характеристик продукції рослинництва. Зокрема, шляхом генетичної трансформації рослин ведуться роботи, спрямовані на зменшення накопичення шкідливих речовин, збільшення накопичення корисних, а також на підвищення дієтичних, харчових, смакових якостей продукції. Прикладом робіт зі зменшення накопичення токсичних речовин може бути створення батату, який не накопичує ціаногенні глікозиди в коренях та листках. Такі ціаногенні глікозиди, як лінамарин та лотаустралін, викликають різні захворювання, разом з тим батат є важливим продуктом харчування близько 400 млн. чоловік.

Размещено на

Рис. 1. Основні напрями створення генетично модифікованих сільськогосподарських культур

Серед генів, експресія яких у рослинах вважається екзотичною, найбільш важливими є гени, що кодують синтез поліпептидів, важливих для медицини. При цьому трансгенні рослини володіють низкою переваг порівняно з культурою клітин мікроорганізмів, тварин та людини для виробництва рекомбінантних білків. Серед переваг трансгенних рослин основними є можливість великомасштабного отримання, дешевизна, простота очистки, відсутність домішок, що мають алергенну, імуносупресивну, канцерогенну, тератогенну та інші побічні дії на організм людини. Рослини можуть синтезувати, глікозилювати та складати із субодиниць білки ссавців. При споживанні сирих овочів та фруктів, що несуть гени, які кодують синтез білків-вакцин, відбувається оральна імунізація. Це має величезне економічне значення, особливо для країн, що розвиваються, в зв'язку зі значним здешевленням отримання оральних вакцин і відсутністю необхідності очистки у випадку переносу цих генів у фрукти та овочі, що вживаються в сирому вигляді.

Виробництво фармацевтичних білків, антитіл, вакцин на основі генно-інженерних підходів є яскравим прикладом тих переваг, які надає сучасна біотехнологія рослин. Такі білки та пептиди називають рекомбінантними, тому що їх отримують з використанням технології рекомбінантних молекул ДНК.

Рослина як природний "біореактор" з виробництва рекомбінантних білків, важливих для медицини, має певні переваги порівняно з клітинами тварин, людини та мікроорганізмів:

* рекомбінантні білки, синтезовані в рослині, не потрібно піддавати денатурації та ресинтезу;

* рослини здатні не лише до синтезу і збирання, а й до глікозилювання білків тварин; це абсолютно необхідно для синтезу антитіл і деяких інших функціонально повноцінних білків;

* рослини, порівняно із клітинами ссавців і трансгенними тваринами, забезпечують значне здешевлення виробництва рекомбінантних білків, причому без обмежень, пов'язаних зі зростанням обсягів такого виробництва; наприклад, якщо середня вартість очищених пептидів, отриманих за допомогою інших сучасних методів, становить 100 тис. - 1 млн. дол. США за 1 кг, то їх вартість у разі отримання із трансгенних рослин дорівнює 1 тис. дол. за 1 кг;

* у препаратах, отриманих із рослин, порівняно з препаратами тваринного чи мікробіологічного походження, значно менше або й зовсім відсутні небажані віруси; відсутні домішки, що мають алергічну, імуносупресивну, канцерогенну, тератогенну дію на організм людини; це зумовлює порівняну легкість очищення синтезованих рослинами фармацевтичних пептидів;

* під час вживання сирих овочів і фруктів, що містять гени, які кодують синтез білків-вакцин, відбувається імунізація організму.

Існує кілька підходів у індукції синтезу рекомбінантних білків у рослинах, основними з яких є:

? * отримання трансгенних рослин із вбудованими генами рекомбінантних білків. Такі рослини, представники різних видів, що несуть різноманітні гени синтезу рекомбінантних білків, вже отримані, деякі з них випробовують для комерційного використання; недоліком цього підходу є відносно невисока концентрація рекомбінантного білка, що зменшує можливість використання таких рослин для виробництва очищених препаратів; тому ця технологія застосовується для виробництва їстівних вакцин або інших білків, які можуть споживатись в неочищеному стані; модифікації, що ґрунтуються на можливості як спонтанної, так і індукованої секреції (ексудації) рекомбінантних білків у поживне середовище у разі вирощування трансгенних рослин в умовах гідропоніки, застосовують для отримання очищених препаратів рекомбінантних білків;

? * використання трансформації хлоропластів. Цей метод дає змогу різко збільшувати кількість потрібного білка в листках трансформованих рослин; так, накопичення соматотропіну людини (гормон росту), ген якого було внесено в хлоропласти тютюну, становило до 7% усього розчинного білка трансформованої рослини; в окремих випадках рівень рекомбінантного білка може навіть досягати понад 40% сумарного розчинного білка; проте широке застосування цієї технології поки що стримується труднощами трансформації хлоропластів;

? * використання позаклітинних генетичних елементів. Перші подібні генетичні конструкції створено на базі РНК-вмісного вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ); ген біосинтезу цільового білка клонують під контролем промотору вірусу (звичайно використовують субгеномний промотор білка оболонки вірусу) у бактеріальному векторі, який містить повну ДНК копію вірусної РНК; потім у безклітинній системі на основі отриманого вектора синтезується вірусна РНК, яка наноситься на пошкоджені листки тютюну або споріднених видів; протягом 1 - 2 тижнів відбувається накопичення вірусних часточок, що містять рекомбінантний білок; така система дає змогу за короткий термін накопичувати значну кількість цільового рекомбінантного білка в листках інфікованої рослини (2 - 10%, іноді до 20% загальної кількості рослинного білка).

Отже, сучасна біотехнологія рослин ґрунтується і використовує останні досягнення різних напрямів біологічної науки і широко застосовується у господарській діяльності: в сільському господарстві, переробній, харчовій, парфумерній, косметичній промисловості, медицині тощо.

2. Векторні системи для переносу генів

Загалом процес трансформації рослинної клітини може бути здійснено або за використання механізмів природного обміну генетичним матеріалом в ході взаємодії з рослиною бактерій роду Agrobacterium, або шляхом прямого введення рекомбінантних ДНК в клітини рослин.

Вектор - молекула ДНК здатна до автономної реплікації і включення в себе чужорідної ДНК.

Вектор крім цільового гену повинен містити елементи необхідні для його реплікації і інтеграції в геном реципієнта, а також регуляторні елементи для експресії гена і селективні маркери, за допомогою яких здійснюється відбір трансформантів.

Для створення трансгенних рослин використовують вектори на основі плазмід, вірусів, хлоропластної і мітохондріальної ДНК, транспозонів.

Вектори на основі агробактеріальних плазмід.

У 70 роках минулого сторіччя було встановлено, що трансформація рослин може відбуватися в природних умовах. Чинником такої трансформації є Agrobacterium tumefaciens. Клітини цього патогену містять велику плазміду, яку прий...